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  • Taurina está diretamente ligada ao Oligomérico Amilóide-β e recupera déficits cognitivos em cobaias com Alzheimer

    A doença de Alzheimer (DA) é a causa mais comum de demência, levando a um declínio cognitivo grave. Durante a progressão da D.A., os monômeros amilóide-β (Aβ) agregam-se em oligometria solúvel neurotóxica Aβ que causa comprometimento cognitivo. Nosso estudo anterior indica que a suplementação oral de taurina a 1000mg / kg / dia melhora significativamente os déficits cognitivos dependentes do hipocampo em cobaias transgênico APP / PS1. No entanto, as placas Aβ e os níveis oligoméricos não são alterados depois da administração de taurina, e a dosagem oral de taurina foi relativamente alta. Assim, neste estudo, focamos na correlação direta entre Taurina e Aβ oligomérica, causando déficits memoriais em uma dose oral menor de taurina, 250mg / kg / dia. Nós induzimos deficiências cognitivas semelhantes à AD em camundongos normais adultos e taurina administrada por via oral por meio de água potável por 10 dias. Confirmamos ainda que, a administração de taurina melhorou os déficits cognitivos em camundongos oligoméricos com infusão de Aβ em labirinto em Y e testes de esquiva passiva sem alteração na atividade de camundongos. Além disso, encontramos taurina diretamente ligada a Aβ oligomérico em análises de ressonância plasmônia de superfície. Nossos resultados sugerem que a taurina pode melhorar o comprometimento cognitivo por meio da ligação direta a oligoméria Aβ na administração oral de 250mg / kg / dia por 10 dias. 

    1. INTRODUÇÃO 

    A Taurina, que é uma pequena molécula endógena natural, está envolvida em muitos processos fisiológicos do corpo humano, como a estabilização da via proteíca anti-inflamatória e a homeostase do cálcio (Schaffer et al. 1995; Huxtable 1992; Miao et al. 2012). Devido às suas propriedades corretivas, a taurina tem sido usada para tratar vários distúrbios, como insuficiência hepática e cardíaca (Matsuyama et al. 1983; Azuma et al. 1985). Nosso estudo anterior relata que a administração oral de taurina recupera os déficits cognitivos no modelo de camundongo transgênico da doença de Alzheimer (AD) de APPswe / PS1dE9 (Kim et al. 2014). A DA é uma doença neuro degenerativa caracterizada pela deposição aberrante de amilóide-β (Aβ) no cérebro.  Os monômeros Aβ são agregados em um oligomérico Aβ, que desempenha um papel crítico no rompimento da função cognitiva (Ferreira et al. 2015). Este modelo de camundongo transgênico expressa proteína precursora amilóide humana mutante (APP) e proteína presenilina-1 (PS1) (Janknowsky et al. 2001). Essas mutações, APPSwe e PS1dEE9, estão associadas à produção anormal de Aβ. Embora a administração de taurina tenha melhorado o declínio cognitivo semelhante à DA, a alteração dos níveis de Aβ foi pouco encontrada. Considerando que camundongos AD transgênicos APP / PS1 exibem números de fenótipos patológicos semelhantes a DA, como glicose, bem como superprodução de vários agregados e truncados Aβ (Kamphius et al., 2012), não é adequado investigar a clara correlação entre taurina e oligoméria Aβ. Assim, neste estudo, utilizamos um camundongo AD agudo para resolver o problema. Para induzir déficits cognitivos agudos semelhantes à DA, infundimos Aβ oligomérico no ventrículo lateral por meio de injeção intra cérebro ventricular em cérebro de camundongo cognitivamente normal (Kim et al., 2016). Dado que a função cognitiva desse camundongo com DA é afetada pela Aβ oligomérica por injeção direta, é possível estudar a correlação direta entre a taurina e a Aβ oligomérica. A taurina dissolvida em água potável foi administrada por via oral em ratos oligoméricos com infusão de Aβ por 10 dias. Durante a administração de taurina, labirinto em Y e testes de esquiva passiva foram realizados para avaliar as funções cognitivas de ratos oligoméricos com infusão Aβ. Além disso, realizamos análise de ressonância plasmônica de superfície para investigar as interações moleculares entre a taurina e a Aβ oligomérica.  

    1. MÉTODOS 
    1. MATERIAIS 

    Dimetilsulfóxido (DMSO) e taurina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, EUA). A solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi adquirida à Gibco (Waltham, Massachusets, EUA). A água desionizada foi produzida pelo sistema de água ultrapura Milli-Q da Millipore (Darmstadt, Alemanha). Microsyringe foi comprada da empresa Hamilton (Bonaduz, Suíça). 

    2.2.  Cobaias com infusão  oligomérica e administração oral de Taurina. 

    Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o guia do Instituto Nacional de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório (8ª edição) e o Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal do KIST (Seul, Coréia). 

    Camundongos C57B1 / 6 (machos, 6 semanas de idade, n = 7) foram comprados na Orient Bio Inc. (Seul, Coreia). Para obter Aβ oligomérico, Aβ 42 (100µM, 10% DMSO em PBS) foi incubado a 37 ° C por 1 semana. Em seguida, injectaram-se 5µL de Aβ oligomérico ou veículo (DMSO a 10% em PBS) no ventrículo lateral no cérebro de ratinho através de injecção intracerebroventricular (ICV). Aβ 42 foi sintetizado com um sintetizador automático de peptídeos (Choi et al. 2012). Os oligômeros Aβ foram injectados no dia 0 da experiência e a taurina foi administrada oralmente desde o dia -3 até ao dia 7 a 250 mg / kg / dia. Para o cálculo da dosagem exata de taurina, foram medidos o peso corporal e o consumo diário de água dos camundongos. Além disso, alterações na saúde, como perda de cabelo e peso corporal, não foram observadas. 

    2.3. Teste Comportamental 

    Teste do labirinto em Y. O teste do labirinto em Y foi utilizado para avaliar a memória espacial de trabalho dos roedores. O aparelho do labirinto em Y era feito de plástico preto com 3 braços (40 L x 10 W x 12 H cm). Os braços foram afastados a 120º um do outro. Um rato foi colocado no final de um braço e permitiu explorar os braços em forma de y por 12 min. Uma entrada bem-sucedida foi considerada quando a cauda inteira do camundongo chegou dentro de um braço. As sequências de entradas do braço foram registradas. 

    Teste de evitação passiva. O teste de evitação passiva foi realizado para avaliar o medo e motivar a memória hipocampo dos roedores. O aparelho era composto por uma câmara escura, equipada com um gerador de choque de pé e uma câmara de luz. Na fase de aquisição, um rato foi colocado no compartimento luminoso. Após 20 s, a porta que dividia as câmaras foi aberta, e o camundongo moveu-se instintivamente para o compartimento escuro. Quando todos os quatro membros vieram dentro da câmara escura, o rato recebeu um choque elétrico (0,2mA, 1 seg. Uma vez). No dia seguinte, na fase de retenção, cada rato foi novamente colocado na área brilhante. O tempo de latência foi registrado manualmente (corte 500s). 

    2.4. Análise de ressonância plasmônica de superfície 

    A análise de superfície de ressonância plasmônica foi conduzida usando Biacore T200 instrumento e chips sensor de matriz dextrana carboximetilada (S5) S (Ritcher et al. 2010). Utilizou-se HBS-EP + (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM e surfactante 0,05% P20) como tampão de corrida a 25ºC. oligômeros Aβ (200 µg/mL) foi diluído com 10mM de solução de acetato de sódio (pH 4.0 e pH 5.5, respectivamente, para fazer 40 µg/mL de oligômeros  Aβ. Posteriormente, o oligómero AB foi covalentemente imobilizado na superfície do chip por reação de acoplamento de amina. Os restantes grupos carboximetilo activados na superfície foram bloqueados por injecção de etanolamina 1 M (pH 8,0). O valor de imobilização do Aβ oligomérico foi de 9000 RU e a Rmax teórica do Aβ oligomérico foi de 249,4 RU. A taurina foi preparada em tampão de corrida PBS-T (fosfato 10 mM, NaCl 135 mM, KCI 27 mM e 0, 005% de surfactante P20) como amostras diluídas em série. Para o ensaio de ligação cinética, a taurina foi injectada durante 120s e um fluxo  de 30 / min. 

    2.5 Anáilises estatísticas 

    Análise de significância estatística entre os grupos controle e experimental foi realizada com o teste t de Student (* P <0,05, ** P <0,001, *** 0,001, n .: não significância). Os valores de SEM foram indicados por barras de erro. 

    1. Resultados 

    3.1. A Taurina Melhora Déficits Cognitivos no Modelo de Mouse Oligomérico com Infusão  

    Em resultados comportamentais do nosso estudo anterior, confirmamos que a suplementação de taurina a 100 mg / kg / dia alivia o declínio cognitivo em camundongos transgênicos de APPswe / PSdE9. No entanto, esta concentração de taurina é relativamente alta para desenvolver drogas para pacientes com DA. A fim de verificar o efeito terapêutico da taurina em uma menor dose, ajustamos a dose de administração de taurina em 250 mg / kg / dia. Administramos por via oral taurina ao grupo oligomérico de infusão de Aβ (masculino, 7 semanas de idade, n = 7) por 10 dias. Para investigar os efeitos da taurina no cognitivo causado por Aβ oligomérico, induziu-se deficiências cognitivas agudas semelhantes à DA a camundongos C57B1 / 6 do tipo selvagem (machos, 7 semanas de idade, n = 7) via injeção intracerebroventricular. 

    Para avaliar as funções cognitivas dos camundongos com veículo e infusão oligomérica Aβ, eles foram submetidos a testes comportamentais, incluindo labirinto em Y e testes de esquiva passiva. O teste do labirinto em Y foi realizado para avaliar a memória de trabalho espacial do modelo de roedores. Durante esta experiência, os ratos foram autorizados a explorar os braços em forma de y. As sequências de entradas dos braços foram registradas para calcular a alternância espontânea. Encontramos memória de trabalho espacial de ratos oligoméricos com infusão Aβ e que o número total de entradas no braço indicando atividade comportamental de camundongos não diferiu de outros grupos de camundongos. 

    Após a conclusão do teste do labirinto em Y, realizamos o teste de esquiva passiva para avaliar a memória do hipocampo motivada pelo medo. O teste de evitação passiva foi realizado com base na preferência instintiva de camundongos por condições escuras. Maior latência de resposta na fase de retenção indicou melhor memória hipocampo. Neste estudo, confirmamos que a taurina aumenta significativamente a memória do hipocampo em ratos oligoméricos com infusão de Aβ. 

    3.2 Taurina Vincula-se Diretamente à Oligomeric  

    A degeneração sináptica no hipocampo e córtex está fortemente correlacionada com deficiências cognitivas (Huang e Mucke 2012; Selkoe 2002; Sheng et al. 2012). O Aβ oligomérico induz perda de memória por ligação a sinapses maduras e inibição da função sináptica (Lacor et al. 2004). Assim, hipotetizamos que, ao se ligar diretamente ao Aβ oligomérico, a taurina pode inibir a sinaptotoxicidade do Aβ oligomérico. Para examinar as interações moleculares entre a taurina e o oligômero Aβ, realizamos a análise de ressonância plasmônica de superfície (SPR). Inicialmente, os oligômeros Aβ foram imobilizados em um chip sensor CM5 através da reação de acoplamento amina. Em seguida, a taurina foi injetada na célula de fluxo do sistema Biacore T200 em várias concentrações (de 0,3 a 19,2 nM). Nesta análise, descobrimos que a taurina se liga diretamente à Aβ oligomérica de maneira dose-dependente. Este resultado sugere que a taurina inibe os déficits oligoméricos de memória induzidos pela Aβ, interagindo com Aβ oligomérico. Em conjunto, em estudos comportamentais, confirmamos que a suplementação de taurina a 250 mg / kg / dia melhora os déficits cognitivos em camundongos com infusão Aβ oligomérica em uma extensão similar à concentração previamente determinada de 1000 mg / kg / dia. Além disso, descobrimos que a taurina se liga diretamente ao Aβ oligomérico. Dado que o Aβ oligomérico induz comprometimento cognitivo pela ligação a receptores seletivos nas sinapses neuronais, o aumento do aprendizado e da memória em modelos de camundongos oligoméricos com infusão Aβ sugere que a taurina pode prevenir déficits de memória por ligação direta ao Aβ oligomérico. 

    1. Discussão 

    Aqui relatamos que (1) a administração oral de taurina melhora os déficits cognitivos semelhantes à DA induzida por Aβ  oligomérico em modelo de camundongo com infusão Aβ oligomérica, (2) taurina interage diretamente com Aβ oligomérico e (3) diminuindo a dose da administração oral, 250mg / kg / dia, e encurtando a duração da captação, 10 dias, de taurina é eficaz para prevenir comportamentos cognitivos tipo Alzheimer em camundongos. 

    Neste estudo, confirmamos que a taurina se liga ao Aβ oligomérico usando análise de ressonância plasmônica de superfície. Esses resultados seguem nossa observação anterior de que substâncias químicas semelhantes à taurina se ligam diretamente ao Aβ e apóiam nossa hipótese de que a taurina pode interagir com o Aβ oligomérico. Assim, propomos que a taurina pode aliviar o declínio cognitivo no modelo oligomérico de camundongos com infusão Aβ por ligação direta ao Aβ oligomérico. No entanto, mais estudos são necessários para entender como a taurina interage com os oligômeros Aβ, uma vez que apenas confirmamos a capacidade da taurina se ligar ao Aβ  oligomérico. 

    Nosso estudo atual mostra que a taurina induz efeito terapêutico em uma dose mais baixa do que a previamente estudada. Portanto, esses achados aumentam o potencial terapêutico da taurina como droga para melhorar os déficits cognitivos em pacientes com DA. Além disso, nossas descobertas sobre as interações moleculares entre a taurina e o Aβ oligomérico podem levar a uma maior elucidação dos mecanismos subjacentes à melhora cognitiva mediada pela taurina. 

    1. Conclusão 

    Nosso atual estudo sugere que a administração oral de taurina a 250 mg / kg / dia melhora o comprometimento cognitivo ao se ligar diretamente ao Aβ oligomérico. 

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